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華東理工大學開發(fā)高效NADPH再生系統(tǒng)
發(fā)布時間：
2023-07-18
在當前的制藥工業(yè)中，酶催化的氧化還原反應起著至關重要的作用。作為最常用的氫供體，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）幾乎占據了生物催化氧化還原過程的90%。然而，野生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（FDH）大多數依賴于NAD，相較于其他酶類工具如葡萄糖脫氫酶，其催化活性表現(xiàn)較差。因此，為了實現(xiàn)可靠且穩(wěn)健的NADPH再生系統(tǒng)，需要開發(fā)高效且能夠利用NADP的FDH。
T4T7 解碼合成生物 2023-07-18 18:45 發(fā)表于上海
在當前的制藥工業(yè)中，酶催化的氧化還原反應起著至關重要的作用。作為最常用的氫供體，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）幾乎占據了生物催化氧化還原過程的90%。然而，野生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（FDH）大多數依賴于NAD，相較于其他酶類工具如葡萄糖脫氫酶，其催化活性表現(xiàn)較差。因此，為了實現(xiàn)可靠且穩(wěn)健的NADPH再生系統(tǒng)，需要開發(fā)高效且能夠利用NADP的FDH。
近日，華東理工大學許建和團隊在《ChemBioChem》雜志發(fā)表了題為“Engineering a Formate Dehydrogenase for NADPH Regeneration”的研究論文，報道了一個新的來自杜氏假絲酵母的甲酸脫氫酶（CdFDH），通過結構引導的理性設計使得CdFDH未展現(xiàn)出嚴格的NAD偏好性，并具有良好的NADP利用能力，能夠支持不同NADPH依賴的生物催化反應。
圖1. CdFDH的蛋白結構和突變進化路徑
在之前的研究中，該團隊通過理性設計，成功改造了一個來自伯克霍爾德菌（Burkholderia stabilis）的NADP依賴性突變體（BstFDH-G146M/A287G）。然而，進一步的隨機突變未能獲得更高催化活性的突變體。因此，研究人員轉向了其他FDHs，尋找更好的蛋白質工程起點。而CdFDH作為NADP依賴性FDH的一個全新成員，成為了理想的研究對象。通過結構引導的理性/半理性設計，CdFDH沒有表現(xiàn)出嚴格的NAD依賴性，并且在構建的組合突變體CdFDH-M4（D197Q/Y198R/Q199N/A372S/K371T/?Q375/K167R/H16L/K159R）中，其對NADP的催化效率（kcat/Km）提高了75倍。CdFDH-M4在多種不對稱氧化還原過程中表現(xiàn)出色，其輔酶總周轉數（TTN）范圍從135增至986，使其具備潛力能夠用于需要NADPH的生物催化反應。
圖2. 野生型和突變體M4輔因子結合環(huán)境比較
之后，該團隊以2.3 Å的分辨率成功得到了最佳突變體CdFDH-M4與NADP的共結晶（PDB：8J3P）。研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，煙酰胺輔酶的結合環(huán)境發(fā)生了巨大的變化，因此導致了更好的NADP適應性。突變位點D197Q、Y198R和Q199N，CdFDH-M4在NAD(H)核糖的羥基附近提供了更大的空間，以容納的磷酸基團，突變位點Gln197、Arg198和Asn199殘基與NAD(P)H的磷酸基團也形成了氫鍵網絡。此外，突變位點A372S則引入了全新的氫鍵網絡（圖2），并且，來自另一個亞基的Lys3與NAD(P)H的磷酸基團支持了額外的極性接觸，而在野生型酶中沒有觀察到這種情況。
總之，這項研究成功改造了一種高效的NADP依賴的FDH突變體（CdFDH-M4），為煙酰胺輔酶的再生提供了有力支持。CdFDH-M4具有良好的NADP利用能力，能夠支持不同類型NADPH依賴的生物催化反應。結構分析和分子動力學研究揭示了突變位點在促進底物/輔酶結合以及FDH催化循環(huán)轉化方面的關鍵作用。同時，研究也為擴展NADPH再生系統(tǒng)提供了有價值的示例，為改進該FDH超家族的輔因子偏好性提供了啟發(fā)。
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